ELISA组织样本处理：老技师的避坑指南，别再被“大全”忽悠了！

开篇警告：别信那些“大全”，样本处理才是王道！

现在网络上啊，充斥着各种“ELISA组织样本处理步骤图片大全”、“PDF合集”，看着挺唬人，点进去一看，要么是互相抄来抄去，一点新东西都没有；要么就是泛泛而谈，根本解决不了实际问题。很多年轻实验员，就喜欢照着这些东西依葫芦画瓢，结果可想而知。我告诉你，ELISA的成败，样本处理是重中之重！容不得半点马虎！试剂盒再好，抗体再牛，样本处理不好，一切都是白搭！今天我就结合我几十年的经验，好好跟你们唠唠，怎么把这组织样本处理好。

组织类型细分：不同组织，不同对待

别跟我说“组织样本”四个字就概括了。组织类型不同，处理方法肯定不一样！常见的组织类型，我给你们分成三种：新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织。每种组织的处理方法，都有细微差别，必须明确指出。

• 新鲜组织： 最好！首选！能最大程度保留蛋白的活性和完整性。但处理速度要快，防止降解。
• 冰冻组织： 次选。取材后迅速液氮速冻，然后-80℃保存。解冻要快，避免反复冻融。
• 石蜡包埋组织： 实在没办法的选择。经过固定、脱水、包埋等步骤，蛋白可能发生变性，抗原表位也可能被破坏。需要进行脱蜡、水化、抗原修复等步骤才能进行ELISA。

详细步骤与注意事项：步步为营，精益求精

取材：大小、工具、保存，一个都不能少

• 取材大小： 一般来说，50-100mg的组织就足够了。太少了，蛋白浓度可能不够；太多了，匀浆可能不充分。具体大小，还得根据你的目的蛋白的表达量来调整。
• 工具选择： 必须使用干净、无菌的手术器械。最好是使用一次性的刀片和镊子，避免交叉污染。取材刀片要锋利，减少对组织的挤压。
• 保存方式： 新鲜组织最好立即处理。如果不能立即处理，可以放在冰冷的PBS或者生理盐水中暂存，但时间不能超过2小时。冰冻组织要放在干冰或者液氮中运输，避免解冻。石蜡包埋组织可以在室温下长期保存。

不同组织取材的特殊要求：

• 皮肤组织： 含有大量的脂肪，会干扰ELISA结果。取材后，可以用二甲苯或者其他有机溶剂去除脂肪。但要注意，有机溶剂可能会对蛋白造成影响，所以要控制好时间和温度。可以采用刮除皮下脂肪的方式，减少有机溶剂的使用。
• 骨组织： 含有大量的钙盐，会影响匀浆和蛋白提取。取材后，需要进行脱钙处理。常用的脱钙液是EDTA或者盐酸。脱钙时间要根据骨组织的密度和大小来调整，一般需要数天甚至数周。脱钙后，要充分漂洗，去除残留的脱钙液。

取材效果对比图：

匀浆：介质、方法、温度，环环相扣

• 匀浆介质的选择： 常用的匀浆介质有PBS、Tris、RIPA等。RIPA裂解液含有去垢剂，能更有效地裂解细胞，提取蛋白。但是，RIPA裂解液可能会对某些抗体产生干扰，所以要根据具体情况选择。PBS和Tris缓冲液比较温和，适用于提取对去垢剂敏感的蛋白。具体选择哪种介质，要根据你的目的蛋白的性质和抗体的特性来决定。

  匀浆介质	适用范围	优点	缺点
  PBS	适用于提取对去垢剂敏感的蛋白	温和，对蛋白活性影响小	裂解效果较差，可能需要辅助手段（如超声）
  Tris	适用于提取对去垢剂敏感的蛋白，且需要维持特定pH值的实验	可以维持特定pH值，缓冲能力强	裂解效果较差，可能需要辅助手段（如超声）
  RIPA	适用于大多数蛋白的提取，尤其是不溶性蛋白	裂解效果好，蛋白提取率高	可能对某些抗体产生干扰，含有去垢剂

• 匀浆方法的选择： 手工匀浆、机械匀浆、超声匀浆，各有优缺点。手工匀浆适用于少量样本，操作简单，但效率较低。机械匀浆适用于大量样本，效率高，但可能产生热量，导致蛋白降解。超声匀浆适用于难裂解的组织，效率最高，但容易产生热量，且可能破坏蛋白结构。

  匀浆方法	适用范围	优点	缺点
  手工匀浆	少量样本	操作简单，成本低	效率低，不适用于大量样本
  机械匀浆	大量样本	效率高，适用于大量样本	可能产生热量，导致蛋白降解
  超声匀浆	难裂解的组织	效率最高，适用于难裂解的组织，如骨组织	容易产生热量，且可能破坏蛋白结构，需要优化参数（功率、时间、频率）
  * 匀浆过程中如何控制温度，避免蛋白降解： 匀浆过程中，蛋白酶的活性会升高，导致蛋白降解。所以，必须在冰浴中进行匀浆，或者使用预冷的匀浆介质。如果使用机械匀浆或者超声匀浆，要注意控制时间和功率，避免产生过多的热量。可以在匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶的活性。

• 匀浆后如何去除细胞碎片和未溶解的组织： 匀浆后，会产生大量的细胞碎片和未溶解的组织，这些杂质会干扰ELISA结果。所以，必须进行离心，去除这些杂质。离心速度和时间要根据组织的类型和匀浆介质来调整。一般来说，12000g，4℃，10分钟的离心条件就足够了。离心后，取上清液进行后续的实验。如果上清液仍然浑浊，可以进行二次离心。

匀浆效果对比图：

蛋白定量：方法、误差、稀释，精打细算

• 蛋白定量方法的选择： 常用的蛋白定量方法有BCA和Bradford。BCA法的灵敏度较高，受去垢剂的影响较小，但操作比较繁琐。Bradford法操作简单，速度快，但受去垢剂的影响较大，且不同蛋白的显色程度不同。

  定量方法	优点	缺点	适用范围
  BCA	灵敏度高，受去垢剂影响小，线性范围宽	操作繁琐，试剂配制复杂，耗时较长	适用于蛋白浓度较低的样本，以及含有去垢剂的样本
  Bradford	操作简单，快速，成本低	受去垢剂影响大，不同蛋白的显色程度不同，线性范围窄	适用于蛋白浓度较高的样本，且不含或含有少量去垢剂的样本

• 如何减少蛋白定量误差： 使用标准品制作标准曲线，标准品的浓度要准确。使用相同的比色皿，避免光程差异。在测定样本前，要充分混匀，避免沉淀。每个样本至少测定三个复孔，取平均值。如果样本浓度过高，要进行稀释，但要注意稀释倍数。

• 稀释倍数的选择对结果有什么影响： 稀释倍数过小，可能导致蛋白浓度超出标准曲线的范围，无法准确测定。稀释倍数过大，可能导致蛋白浓度过低，超出仪器的检测下限。所以，要根据样本的蛋白浓度，选择合适的稀释倍数。一般来说，稀释后的蛋白浓度应该在标准曲线的中间段。

不同稀释倍数的标准曲线对比图：

（此处应有标准曲线图，展示不同稀释倍数对标准曲线的影响，并附带详细的文字说明）

样本保存：时间、温度、方式，小心翼翼

• 处理后的样本如果不能立即进行ELISA检测，应该如何保存： 处理后的样本，最好立即进行ELISA检测。如果不能立即检测，可以分装后，-80℃保存。避免反复冻融。
• 保存时间对结果有什么影响： 保存时间越长，蛋白降解的风险越高，ELISA结果的可靠性越低。一般来说，-80℃保存的样本，可以保存数月。但最好还是尽快进行检测。
• 不同保存方式（如-80℃，液氮）的差异是什么： 液氮保存的温度更低，可以更好地抑制蛋白酶的活性，延长样本的保存时间。但是，液氮保存的成本较高，且操作比较麻烦。-80℃保存的成本较低，操作简单，适用于大多数样本的保存。

特殊情况处理：红细胞、脂肪、纤维，各个击破

• 如何处理含有大量红细胞、脂肪、纤维结缔组织的样本： 含有大量红细胞的样本，会干扰蛋白定量和ELISA结果。可以加入红细胞裂解液，去除红细胞。含有大量脂肪的样本，可以用二甲苯或者其他有机溶剂去除脂肪。含有大量纤维结缔组织的样本，可以用胶原酶或者其他蛋白酶消化纤维组织。
• 如何避免非特异性结合： 使用封闭液封闭酶标板，减少非特异性结合。封闭液常用的有BSA和脱脂奶粉。选择合适的抗体，抗体的特异性越高，非特异性结合越少。优化ELISA的洗涤步骤，充分洗涤，去除未结合的抗体和酶标物。
• 如何排除内源性酶的干扰： 有些组织含有内源性酶，如过氧化物酶和碱性磷酸酶，会干扰ELISA结果。可以加入相应的抑制剂，抑制内源性酶的活性。例如，可以使用叠氮化钠抑制内源性过氧化物酶的活性。

避坑指南：这些坑，千万别踩！

• 组织裂解不充分： 导致蛋白提取率低，ELISA结果假阴性。解决方法：选择合适的匀浆介质和匀浆方法，延长匀浆时间，增加匀浆次数。
• 蛋白浓度过低： 导致ELISA结果不稳定。解决方法：增加取材量，优化蛋白提取方法，浓缩蛋白。
• 样本污染： 导致ELISA结果假阳性或者假阴性。解决方法：使用无菌的器材和试剂，避免交叉污染。
• 抗体选择不当： 导致ELISA结果不准确。解决方法：选择特异性高、灵敏度好的抗体，验证抗体的适用性。
• 操作步骤不规范： 导致ELISA结果重复性差。解决方法：严格按照操作手册进行操作，注意细节，做好质控。

总结与展望：没有最好，只有更好

我再强调一遍，ELISA的成败，样本处理是关键！一定要根据自身实验的具体情况，不断优化处理方法。现在技术发展这么快，以后肯定会出现更多更先进的组织样本处理方法，比如微流控技术，可以实现自动化、高通量的样本处理。希望你们年轻人，能不断学习，不断进步，把ELISA实验做得更好！

记住，ELISA不是万能的，如果样本处理不好，再好的试剂盒也做不出好结果！